如何减少柱外体积

更新时间：2022-09-06 点击次数：1145

柱外体积（ECV）是指色谱系统从进样器到检测器这段管路除去色谱柱的总体积。大部分新的高效液相色谱系统都经过了优化，因此，可以使用高效的核壳颗粒（SPP）色谱柱，例如HALO。

现在让我们简单概述一下高效液相色谱系统。一个典型的HPLC系统由脱气机、泵、自动进样器、柱温箱和检测器。我们可以仔细看一下里面。

柱外体积通常来自进样器，包括进样器本身、连接进样器与色谱柱的管路以及连接色谱柱与检测器的管路、检测器流通池、热交换器以及各个连接配件所产生的任何体积。

但是有很多旧的色谱仪仍在使用。旧的色谱仪使用颗粒更大、长度更长的色谱柱，因此进样器和管路的柱外体积对分离度和峰宽的影响比较小。在切换到更短的SPP色谱柱时，需要减少柱外体积，以避免峰值展宽，从而降低分离度以及定量结果的准确度。

为了使色谱柱获得良好的性能，应该尽量减少柱外体积，以获得色谱柱的最佳分离。通常，需要将柱外体积降至总峰值体积的一半以下，以获得色谱柱最大分离效果。

如何使柱外体积达到最小？

第一，进样体积。要确保把进样体积控制在最小。

第二，样品溶剂。尽量保持样品的溶剂强度等于或小于初始流动相。如果必须使用*的有机溶剂作为样品溶剂，那么要尽可能减少进样量。

第三，柱前管路。需要确保您使用的是最小内径的管路。请注意，在样品流路中使用几种不同内径的管路可能会导致额外的扩散。对于梯度分离，通常可以忽略柱前管路对柱外体积的影响，但是，这个体积会对梯度延迟体积有影响。

第四，热交换器体积。有些仪器有不同体积的热交换器可供选择。当使用高柱温时，这有助于使流动相与色谱柱之间的温度相匹配。您需要使用与流速一致的最小体积的热交换器，特别是对于2.1mm内径色谱柱。

第五，柱后管路。需要确保您使用的是最小内径的管路。请注意，在样品流路中使用几种不同内径的管路可能会导致额外的扩散。对于20-50mm 2.1mm内径的色谱柱，75或100μm内径的管路可能会提供更好的结果，但是这会产生更高背压。

第六，流通池体积。对于2.1mm和3mm内径的色谱柱，通常使用1-5μl的流通池。更大的流通池通常用于4.6mm内径更长的色谱柱。

示例

让我们来看一个例子。下图展示了2μm 3.0×150mm HALO色谱柱在标准HPLC系统和UHPLC系统的等度分离性能对比。本例中，标准HPLC的柱外体积是64μl，UHPLC的柱外体积是16μl。在标准HPLC中，超快速的HALO色谱柱分析时间略长，且由于峰展宽，塔板数更低。此外，分离度比HALO色谱柱预计的要低。在转移至具有更低柱外体积的UHPLC时，HALO色谱柱提供了更快速更高分离度的分离。

常规HPLC仪器的优化

如果您没有UHPLC仪器，不用担心。您可以通过以下几个方面来优化您的系统以获得更高的性能。

当在常规的HPLC仪器上使用高效的SPP色谱柱（如HALO）时，我们建议您按照以下几个步骤进行系统优化。先从简单、便宜的优化开始，然后根据需要再进行更复杂和更昂贵的优化。一旦您取得了可以接受的结果，您可以选择放弃后续的优化。

第一，减少检测器的响应时间，提高数据采集频率。将检测器响应时间设置为小于0.1秒，并且数据采集频率大于20Hz。例如，在这个色谱叠加图中，您可以清楚地看到，随着数据采集频率的提高，塔板数也从11000增加到38000。

第二，将进样体积减少到最小，并确保能达到可接受的峰值响应。

第三，确保样品溶剂强度比流动相弱。如果这不能满足，那么需要对您的进样体积有所限制。如果是梯度分离，那么您能够注入比等度分离更多的样品。然而，保持样品溶剂强度小于初始流动相的强度仍然是重要的。

第四，使用体积更小，长度更短的管路。

第五，使用更小的流通池。