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如何减少柱外体积

更新时间:2022-09-06      点击次数:1027

     柱外体积(ECV)是指色谱系统从进样器到检测器这段管路除去色谱柱的总体积。大部分新的高效液相色谱系统都经过了优化,因此,可以使用高效的核壳颗粒(SPP)色谱柱,例如HALO。


     现在让我们简单概述一下高效液相色谱系统。一个典型的HPLC系统脱气机、泵、自动进样器、柱温箱和检测器。我们可以仔细看一下里面。



     柱外体积通常来自进样器,包括进样器本身、连接进样器与色谱柱的管路以及连接色谱柱与检测器的管路、检测器流通池、热交换器以及各个连接配件所产生的任何体积。


     但是有很多旧的色谱仪仍在使用。旧的色谱仪使用颗粒更大、长度更长的色谱柱,因此进样器和管路的柱外体积对分离度和峰宽的影响比较小。在切换到更短的SPP色谱柱时,需要减少柱外体积,以避免峰值展宽,从而降低分离度以及定量结果的准确度。


     为了使色谱柱获得良好的性能,应该尽量减少柱外体积,以获得色谱柱的最佳分离。通常,需要将柱外体积降至总峰值体积的一半以下,以获得色谱柱最大分离效果。


如何使柱外体积达到最小?


第一,进样体积。要确保把进样体积控制在最小。


第二,样品溶剂。尽量保持样品的溶剂强度等于或小于初始流动相。如果必须使用*的有机溶剂作为样品溶剂,那么要尽可能减少进样量。


第三,柱前管路。需要确保您使用的是最小内径的管路。请注意,在样品流路中使用几种不同内径的管路可能会导致额外的扩散。对于梯度分离,通常可以忽略柱前管路对柱外体积的影响,但是,这个体积会对梯度延迟体积有影响。


第四,热交换器体积。有些仪器有不同体积的热交换器可供选择。当使用高柱温时,这有助于使流动相与色谱柱之间的温度相匹配。您需要使用与流速一致的最小体积的热交换器,特别是对于2.1mm内径色谱柱。


第五,柱后管路。需要确保您使用的是最小内径的管路。请注意,在样品流路中使用几种不同内径的管路可能会导致额外的扩散。对于20-50mm 2.1mm内径的色谱柱,75或100μm内径的管路可能会提供更好的结果,但是这会产生更高背压。


第六,流通池体积。对于2.1mm和3mm内径的色谱柱,通常使用1-5μl的流通池。更大的流通池通常用于4.6mm内径更长的色谱柱。


示  例
     让我们来看一个例子。下图展示了2μm 3.0×150mm HALO色谱柱在标准HPLC系统和UHPLC系统的等度分离性能对比。本例中,标准HPLC的柱外体积是64μl,UHPLC的柱外体积是16μl。在标准HPLC中,超快速的HALO色谱柱分析时间略长,且由于峰展宽,塔板数更低。此外,分离度比HALO色谱柱预计的要低。在转移至具有更低柱外体积的UHPLC时,HALO色谱柱提供了更快速更高分离度的分离。


 
常规HPLC仪器的优化
      如果您没有UHPLC仪器,不用担心。您可以通过以下几个方面来优化您的系统以获得更高的性能。

     
      当在常规的HPLC仪器上使用高效的SPP色谱柱(如HALO)时,我们建议您按照以下几个步骤进行系统优化。先从简单、便宜
的优化开始,然后根据需要再进行更复杂和更昂贵的优化。一旦您取得了可以接受的结果,您可以选择放弃后续的优化。

     
       第一,减少检测器的响应时间,提高数据采集频率。将检测器响应时间设置为小于0.1秒,并且数据采集频率大于20Hz。例如,在这个色谱叠加图中,您可以清楚地看到,随着数据采集频率的提高,塔板数也从11000增加到38000。


     第二,将进样体积减少到最小,并确保能达到可接受的峰值响应。

   
     第三,确保样品溶剂强度比流动相弱。如果这不能满足,那么需要对您的进样体积有所限制。如果是梯度分离,那么您能够注入比等度分离更多的样品。然而,保持样品溶剂强度小于初始流动相的强度仍然是重要的。
  

     第四,使用体积更小,长度更短的管路。


     第五,使用更小的流通池。




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