Technical Articles

技术文章

当前位置:首页  >  技术文章  >  HALO液相色谱柱的维护与保存

HALO液相色谱柱的维护与保存

更新时间:2022-09-19      点击次数:1040

        为了最大限度地延长高效液相色谱柱的使用寿命并确保其最佳性能,有必要对色谱柱进行适当的维护。许多不同因素可能导致色谱柱分离度和灵敏度降低,但通常情况下,下列因素会导致绝大多数色谱柱出现性能问题。


1、污染物


通常,样品中含有来源于样品基质的成分,这些成分可能会吸附于色谱柱之上。盐、脂类、增塑剂和聚合物是在分析过程中可能与固定相接触的成分。这些成分会损坏色谱柱和检测器,并在分析过程中出现杂质峰。如果这些杂质成分不能被流动相洗脱,它们就会吸附在色谱柱上。随着时间的推移,分析物会与这些杂质产生相互作用,导致保留时间改变以及峰拖尾,从而影响分离。此外,这些杂质的积累可能会造成色谱柱堵塞,导致色谱柱压力升高、泵损坏、并导致色谱柱柱床塌陷,强烈建议使用保护柱来避免这类问题。保护柱是用与分析柱相同的填料填充的短柱,安装在进样器和分析柱之间。使用一段时间后,需要更换一个新的保护柱,以最大限度地延长分析柱的使用寿命。

2、pH不稳定


始终确保色谱柱在pH耐受范围内使用。请查阅色谱柱的使用说明书以确认该柱的pH范围。当保存色谱柱时,应将色谱柱中的酸性或碱性缓冲盐清洗干净。

3、高背压


面多孔颗粒(SPP)的固定相与粒径更小的全孔颗粒(FPP)相比,能在更低的背压下提供更高的分离。药物非临床研究质量管理规范的要求是在尽可能低的压力下运行分析方法,以最大限度的延长仪器和色谱柱的使用寿命。避免压力冲击也是很重要的。压力冲击是指压力在短时间内突然增加或减少。他们可能导致色谱柱柱床塌陷,并导致色谱图峰分叉。

所有2µm产品和1000Å 2.7µm内径为2.1mm和3.0mm色谱柱耐压1000bar。其余规格的色谱柱耐压600bar。如下表所示:

毛细柱


颗粒大小
内径(mm)耐压(bar)
所有0.75和0.1600
所有0.2 – 0.5400


非毛细柱


颗粒大小内径(mm)耐压(bar)
所有

1.0

600
2μm
2.1, 3.01000
2.7µm 1000Å (孔径)2.1, 3.01000
2.7µm2.1, 3.0, 4.6600
3.4 µm 400Å (孔径)2.1, 3.0, 4.6600
5μm
2.1, 3.0, 4.6600

注:“所有"表示所有可用的色谱柱规格型号


4、流动相质量差


必须使用高质量的溶剂(HPLC或MS级)作为流动相,并确保流动相的pH值在所使用的色谱柱的耐受pH范围内。请查阅色谱柱使用与维护指南。质量差的溶剂中往往会含有杂质,会吸附在色谱柱上,从而干扰分离。建议在使用前对流动相进行过滤,在分析过程中使用保护柱有助于除去流动相中的颗粒杂质。


5、柱温过高


为了最大限度的延长色谱柱的使用寿命,柱温不宜超过色谱柱的最高可耐受温度。可耐受温度可以查阅色谱柱使用与维护指南。

6、平衡时间不足


色谱柱的平衡时间取决于色谱柱规格。一般情况下,一根色谱柱可用20倍柱体积的溶剂平衡。请参照以下方程计算柱体积:
①色谱柱体积(µL)= (1/4)(内径×2)(π)(柱长)(孔隙体积)
②π = 3.14
③孔隙体积= 0.50(SPP颗粒)
④内径和柱长以mm为单位

下面给出一个计算案例:
尺寸为2.1 x100mm的色谱柱:
(2.1mm)×2 = 4.41mm
色谱柱柱体积计算:
1/4×4.41×3.14×100×0.50 =173µL =0.17mL

当流速为0.4mL/min时,可以在8.5分钟内达到20倍柱体积。


关于色谱柱堵塞、污染和清洗的提示


1、压力突然增加——所有键合相


一个高的压力峰值或者明显的急剧增加的柱压,通常表明色谱柱被堵塞。为了清除堵塞物,可以尝试反接色谱柱,不接检测器,清洗20倍柱体积以去除色谱柱筛板上的颗粒或者污染物。

——请注意:不建议反冲毛细柱或2µm HALO色谱柱。

2、色谱柱清洗与再生


吸附累积的杂质对色谱柱是有损坏的,但在某些情况下,这些杂质可以被除去。下面将介绍如何能实现这一点。

①所有非毛细柱和粒径>2µm的色谱柱清洗(每项溶剂冲洗10倍柱体积)


C18, AQ-C18, C8, C4, C30, ES-CN, Phenyl-Hexyl, PFP, RP-Amide, Biphenyl和Diphenyl键合相

为了从色谱柱上去除强残留的物质,使用非常强的溶剂(如正在使用的流动相的100%的有机成分)反向清洗色谱柱。如果需要使用更强的溶剂清洗,建议使用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(95/5 v/v)。特殊情况下可能需要使用非常强的溶剂,如DMF或者DMSO。

——请注意:不建议反冲毛细柱或2µm HALO色谱柱。


②所有颗粒的色谱柱再生(每项溶剂冲洗20倍柱体积)

C18, AQ-C18, C8, C4, C30, ES-CN, Phenyl-Hexyl, PFP, RP-Amide, Biphenyl和Diphenyl键合相


如果前述的清洗程序无效,可以尝试使用其他方法再生色谱柱。下面是反相色谱柱(RP)的再生程序。一般来说,再生的过程是相似的,其共同点是使用的清洗溶剂强度增加,并通常以非极性溶剂结束。至关重要的是,所使用的溶剂必须是能够互溶的。
1) 甲醇
2) 乙腈
3) 50/50 ACN/IPA
4) IPA
5) 二氯甲烷
6) 己烷
7) IPA
8) 重新平衡到初始条件

步骤1-4通常足以清洗大多数的色谱柱,但是如果这还不够,可以增加5和6。但是,在使用强非极性溶剂(如己烷)后,在重新平衡到初始溶剂体系之前用IPA清洗过渡是至关重要的,因为水与己烷不互溶。



HILIC和PENTA-HILIC键合相


1、HILIC色谱柱清洗


——请注意:不建议反冲毛细柱或2µm HALO色谱柱

为了从色谱柱上去除强保留的物质,使用50/50甲醇/水等强溶剂反相清洗色谱柱。特殊情况下,可能需要使用非常强的溶剂,如100%的流动相中的极性成分。

另外,二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(95/5 v/v)通常非常有效。对于清洗后的HILIC色谱柱,需要先以70/30 ACN/H2O低流速冲洗2 – 3小时。


2、Penta-HILIC色谱柱清洗


为了从色谱柱上去除强保留的物质,使用10/90甲醇/水等强溶剂反向清洗色谱柱。特殊情况下,可能需要使用非常强的溶剂,如100%的流动相中的极性成分,通常是水。


色谱柱保存(所有键合相)


1、长期保存


长时间保存(超过5天)硅胶基质的色谱柱,建议使用100%乙腈。例外的是Biphenyl,它应该保存在100%甲醇中。

使用含盐流动相后,一定要用等比例不含盐的流动相冲洗色谱柱除盐,然后再用至少10倍柱体积的乙腈冲洗保存。


2、短期保存


短时间保存(低于5天)硅胶基质的色谱柱,可将色谱柱保存在大部分常规使用的流动相中。使用含盐流动相后,一定要用等比例不含盐的流动相冲洗色谱柱除盐,然后再保存。

注意:每根色谱柱在使用之前,请仔细阅读使用说明书!
欢迎您的咨询
我们将竭尽全力为您用心服务
在线客服
关注微信
版权所有 © 2024 北京谱之道科技有限公司  备案号:京ICP备18061150号-4